ניסוי במעבדת ליפידים
תוכן עניינים
Ceramide synthetze
על מנת לסנטז את הספינגוליפיד ceramide משתמשים בשני סובסטראטים - ספינגוזין וחומצת שומן ובאנזים ספציפי לסינטיזה. ישנה קבוצת אנזימים הנקראים cers (צראמיד סינטאטז) ומסומנים כ- CERS1 - CERS6. כל אחד מהאנזימים הללו יודע לעבוד עם טווח של חומצות שומניות באורך מסוים ולסייע בחיבור שלהן לספינגוזין. האנזים הספציפי CERS2 הוא האנזים שבאופן סלקטיבי פועל על החומצות השומניות בעלות 22 ו- 24 פחמנים.
עכברי knockout ועכברי null
על מנת להתחקות אחר ייצור הצראמיד וההשלכות על תפקידיו, משתמשים בעכברים שבהם הגן ליצירת האנזים CERS2 לא פעיל (הומוזיגוטים לגן הרצסיבי)- עכברי knockout או בעכברים שבהם מונעים בדרך שונה את ביטוי הגן ואת יצירתו של האנזים הנ"ל.
סימון רדיואקטיבי לספינגוזין
על מנת לסמן רדיואקטיבית את הספינגוזין, משתמשים בספינגונין בעל קשר כפול, ומגיבים אותו עם סודיום בורוהידראט NaBH4 , שבו המימנים הם איזוטופים רדיואקטיביים - טריטיום. מה שמתרחש הינו הרוויה של הקשר הכפול במימנים בעלי פעילות רדיואקטיבית.
הסינטיזה האנזימטית
משתמשים במיצוי מכבד של עכבר רגיל ובמיצוי של עכבר null. לשני המיצויים הנ"ל מוסיפים את הספינגוזין המסומן רדיואקטיבית וחומצת השומן. מאחר והאנזים בסביבה מימית, והסובסטראטים הינם שומניים, משתמשים בהומוגנייזר, שבנוי משברי ממברנות, וכך מקבלים סביבה קולואידית אחידה, שבה האנזים והסובסטראט יכולים לבוא במגע. בתום הזמן המוגדר מראש עוצרים את התגובה בעזרת תערובת של כלורופורם ומתנול.
מעקב אחר תוצרי התגובה
הבדיקה של תוצר הסינטיזה היא ע"י TLC - כרומטוגרפיה על שכבה דקה של סיליקה, כאשר הנוזל המריץ הוא תערובת נוזלים א-פולאריים. כדי להכין את תערובת התגובה להטענה על פלטת ה- TLC:
- מנדפים את תערובת הכלורופורם/מתנול.
- מוסיפים כלורופורם כדי למצות את החומרים השומניים לפאזה אורגנית.
- מבצעים הפרדה בצנטריפוגה ומסלקים את הנוזל העליון המימי.
- את הפאזה האורגנית מערבבים היטב - ומטעינים על פלטת ה- TLC וממתינים לנידוף הכלורופורם.
בדיקות לאחר ההרצה
ניתן לסמן את הצראמיד והספינגוזין בעזרת יוד, שמסתפח לקשרים כפולים. לשם כך מכניסים את הפלטות אחרי ההרצה לתא שבו גבישים ואדים של יוד. על הפלטה מופיעים כתמים צהובים. בעזרת פילם שרגיש לקרינת ביתא, שנפלטת מהחומר המסומן רדיואקטיבית, ניתן לזהות בפלטה את כתמי הצראמיד ואת כתמי הספינגוזין שלא הגיב.
תוצאות
לאחר שזוהו בפלטת ה- TLC הכתמים שבהם מופיע התוצר שסונטז - צראמיד, מגרדים מהפלטה את האבקה ובתוכה התוצר. כמות התוצר נקבעת ע"י מכשיר למדידת הפעילות הרדיואקטיבית. בטבלה המצורפת מופיעים הערכים שנקבעו הן לצראמיד שנוצר בעכבר רגיל (wild type)והן בעכבר null. הערכים הראשוניים ביחידות DPM (יחידות מנייה), לאחר מכן מתורגמים לכמות בפיקומול (pmol). את הפעילות היחסית של יצירת הצראמיד מחשבים ע"י חלוקה בכמות האנזים שבו השתמשו ובזמן התגובה - כך שמתקבלת פעילות ביח' פיקומול תוצר ליח' אנזים ליח' זמן.
